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海绵共栖细菌中群体感应信号的GC-MS检测

海绵共栖细菌中群体感应信号的GC-MS检测

? 1? 郭秀春1,2? 周文辉1,2? 陈军辉1? 杨佰娟1? 王小如1,2

1国家海洋局第一海洋研究所海洋生态研究中心;2中国海洋大学化学化工学院)

本研究利用气质联用仪(GC-MS)建立了群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯类化合物(AHLs)的检测方法,并利用该方法分析了活性菌株粗提液中信号分子的产生及种类。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

7890N GC/5975N MS型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司);Milli-Q18.2MΩ)超纯水处理系统(美国Millipore公司);N-酰基高丝氨酸内酯标准品(N-己酰基,N-辛酰基和N-十四酰基高丝氨酸内酯)购买于sigma公司,甲醇(色谱纯)。蛋白胨、酵母浸粉、磷酸高铁,以上药品购自世纪华晟国际科技有限公司。实验所用菌株是从南海海绵样品中分离得到的,并且经过活性检测后确定具有抗菌活性的18株海绵共栖细菌。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品制备

N-酰基高丝氨酸内酯标准品(C6-HSLC8-HSLC14-HSL)溶于甲醇配置成浓度为3 mg.mL-1的母液,于-20 °C保存,母液稀释为300 μg.mL-1用于GC-MS检测。

1.2.2 待测菌株粗提物的制备

将活化后的待测菌株接种于装有300 mL MB液体培养基的三角瓶中,25 °C在摇床上震荡(150 rpm)培养7天。培养液离心(8000 rpm.min-1 ×10 min)除去菌体,用乙酸乙酯(100 mL×2)提取上清液,乙酸乙酯相37 °C蒸干,溶于1mL正己烷和二氯甲烷(2:1,v/v)的混合溶液中作为待测菌株的粗提取物。

1.2.3 GC-MS检测条件

气相条件:色谱柱为Agilent HP-5MS石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm);载气为高纯氦气,流速为1 mL.min-1;进样口温度200 °C传输线温度为280 °C。升温程序为:初温150 °C25 °C·min-1280 °C,保持3 min。进样量:1 μL,分流进样(1501),扫描方式为全扫描模式(scan)和选择离子检测(SIM)模式m/z 143

质谱条件:电子能量70 eV,离子源温度230 °C,四极杆温度150 °C

2 结果与讨论

2.1 AHL标准品的GC-MS检测

利用全扫描模式,通过GC-MS3AHLs标准品进行了含量分析,色谱图如图2所示。从图2可以看出,C6-HSLC8-HSLC14-HSL标准混合液在9 min之内完全分离开,保留时间分别为3.741 min4.548 min7.218min

2中检测到的3个峰再通过质谱图进行鉴定。每种化合物的质谱图中都呈现出各自的分子离子峰,即C6-HSLm/z 199),C8-HSLm/z 227),C14-HSLm/z 311)。并且我们从这3种高丝氨酸内酯的离子碎片图中发现,在m/z 143处均含有一个很强的离子峰。这与Cataldi所报道的色谱图相似[14-15]。我们从图3中可以看出C6-HSL的主要电离碎片是m/z 143,其次还有一些特征的碎片,如m/z 156,125,83,71,5743。在C8-HSLC14-HSL的质谱图中也有这些特征碎片,并且均有m/z 143这个很强的离子峰。因此我们决定选择m/z 143作为标记碎片,利用选择离子扫描模式(SIM)用于待测菌株粗提液中AHLs的检测。

2.2 待测菌株粗提液中AHLsGC-MS检测

我们选择SIM模式(m/z 143)用于18株具有抗菌活性的海绵共栖细菌代谢产物粗提液中AHLs的检测,通过将18株待测活性菌株的色谱图与AHLs标准液的色谱图进行比对,结果发现在大多数活性菌株提取液中都至少存在一种AHLs信号分子(C6-HSLC8-HSLC14-HSL)(表1),其中有两株菌株的代谢产物粗提液中均含有这3AHLs信号分子,分别为菌株Pseudovibrio sp. Wcll-1-4-1和菌株Bacillus sp. SYMS-2-14-8(如图4所示)。

近年来,越来越多的学者利用不同的方法在许多微生物中检测到C6-HSLC8-HSLC14-HSL的存在[8,11-12,19-20],在许多海洋细菌,甚至在海绵共栖细菌中也发现了很多AHLs的存在[21-22]。例如早在1997shaw就利用TLC-生物传感器结合的方法从微生物P. fluorescens 2-79Ralstonia solanacearum K60Rhodobacter sphaeroides 2.4.1代谢产物中检测到C8-HSL的存在[8],随后Ravn利用4种细菌生物传感器菌株从148Enterobacteriaceae中有64%可产生AHLs,并且在很多AHLs产生菌代谢产物中都发现了C6-HSLC8-HSLC14-HSL的存在[20]

众所周知,AHLs是革兰氏阴性菌(G-)中介导群体感应的一类重要的信号分子。然而近年来有学者发现AHLs也可以作用于革兰氏阳性菌(G+)群体感应系统,并且在G+中还发现了酰基高丝氨酸内酯酶的存在[23-24]Qazi等发现AHLs可以拮抗Staphylococcus aureus中群体感应和毒性因子的表达[23]Dong等在芽孢杆菌(Bacillus)中检测到群体感应抑制剂酰基高丝氨酸内酯酶,他认为Bacillus可能是利用AHLs作为生长所需的营养物质[24]。但是目前为止,还并未有在Bacillus中发现AHLs的报道。

在本研究中,我们利用GC-MS联用技术建立了快速有效检测群体感应信号分子AHLs的方法,通过检测发现18株活性菌株能够分泌AHLs,初步证实了海绵共栖细菌的抗菌活性与群体感应之间存在密切关系,并且本研究首次在Bacillus属细菌中检测到AHLs的存在。该研究为群体感应研究提供了一条新的思路,并为群体感应信号分子AHLs检测的方法学研究奠定了基础。

(图、表、参考文献略)

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